Aktualny stan technologii CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9, pierwotnie odkryty w 1987 roku przez zespół japońskich naukowców, a następnie udoskonalony przez Jennifer Doudnę w 2012 roku, jest narzędziem do edycji genów, które może wycinać i wklejać dowolne sekwencje genomowe, zarówno in vitro, jak i in vivo. Jest to system, który opiera się na klastrowych, regularnie splecionych krótkich powtórzeniach palindromowych (CRISPR) w celu rozpoznawania obcego DNA i jest stosowany głównie w bakteriach do zwalczania infekcji wirusowych. Narzędzie to przyciągnęło ostatnio wiele uwagi, ponieważ naukowcy dostosowali CRISPR/Cas9 do edycji genomów zwierząt w sposób, który wcześniej był niemożliwy lub nieefektywny, rewolucjonizując badania genetyczne i biomedyczne. CRISPR/Cas9 stał się kluczowym zasobem dla laboratoriów, które potrzebują stabilnych linii komórkowych lub myszy z nokautami, knock-inami lub mutacjami genów, zdolnych do konstytutywnej aktywacji genów lub do edycji mikro-RNA i długo niekodującego RNA.

Aktualne informacje o technologii CRISPR/Cas9

W ciągu ostatnich kilku miesięcy ukazało się kilka interesujących prac charakteryzujących nowe zastosowania CRISPR. W sierpniu Michael Gapinske i jego współpracownicy z University of Illinois at Urbana-Champaign opublikowali metodę pomijania transkrypcji całych eksonów poprzez mutację specyficznych zasad w miejscach splicingu. Ta nowa technika, trafnie nazwana CRISPR-SKIP, wykorzystuje oprogramowanie internetowe, aby pomóc naukowcom określić, gdzie należy dokonać odpowiednich mutacji, i może być przydatna do badania powstawania i funkcji alternatywnie splicowanych genów, a nawet długokodujących RNA, które mają wiele eksonów splicowanych w sposób podobny do mRNA kodującego białka.¹

Tego rodzaju technologia umożliwia kontrolowanie, które części genu ulegają ekspresji, dzięki czemu można całkowicie pominąć te segmenty, których ekspresja powoduje choroby.

Innym nowym zastosowaniem technologii CRISPR są plastry skórne zmodyfikowane za pomocą CRISPR i przystosowane do produkcji enzymu rozkładającego kokainę. Zespół z Uniwersytetu w Chicago wprowadził do komórek macierzystych naskórka gen dla wysoce wydajnej wersji enzymu rozkładającego kokainę, butyrylocholinoesterazy, i stworzył przeszczepy skóry zdolne do wydzielania białka do krwiobiegu. Technika ta może stanowić terapeutyczną drogę zapobiegania przedawkowaniu i wspomagania leczenia uzależnienia od kokainy.²

Naukowcy z University of Washington scharakteryzowali prawie 4000 różnych mutacji w genie BRCA1, aby pomóc w ustaleniu, które z nich są odpowiedzialne za zwiększone ryzyko zachorowania na raka piersi. Wykorzystali oni technologię CRISPR do stworzenia 893 różnych wariantów genu BRCA1 i przetestowali je w haploidalnych komórkach, które umarłyby, gdyby odpowiednie białko BRCA1 nie zadziałało. Badanie zostało zweryfikowane na podstawie dobrze znanych wariantów powodujących raka piersi, które korelowały z innymi niefunkcjonalnymi mutacjami BRCA1 znalezionymi w analizie.³

Idealnie byłoby, gdyby ten duży zbiór danych można było wykorzystać do identyfikacji pacjentów - z których niektórzy mogą mieć rzadkie lub nieliczne mutacje BRCA1 - u których istnieje wysokie ryzyko rozwoju choroby.

Czy kiedykolwiek zobaczymy CRISPR w klinice?

Badania kliniczne nad terapiami opartymi na CRISPR dopiero się rozpoczęły, w tym badania wykorzystujące technologię CRISPR w leczeniu nowotworów złośliwych i chorób genetycznych, takich jak β-talasemia, która jest rzadkim zaburzeniem krwi spowodowanym mutacjami w genie HBB kodującym podjednostkę beta hemoglobiny. Na początku tego roku CRISPR znalazł się w trudnym położeniu, ponieważ opublikowano badanie, w którym zwrócono uwagę na efekty uboczne tej technologii, sugerując, że CRISPR może wycinać lub modyfikować wiele genów niebędących celem, potencjalnie zwiększając ryzyko zachorowania na raka.⁴ Firmy, które specjalizują się w opracowywaniu terapii klinicznych opartych na CRISPR, bardzo mocno straciły na wartości akcje, tracąc w lipcu ponad 300 milionów dolarów. Na szczęście we wrześniu opublikowano wyniki badań przeprowadzonych we współpracy naukowców z AstraZeneca i Uniwersytetu Harvarda, w których opisano nowatorski sposób sprawdzania in vivo, czy nie dochodzi do mutacji poza celem, spowodowanych edycją genów za pomocą CRISPR.⁵

Proces ten, nazwany VIVO, ocenia liczbę dodatkowych mutacji poza celem w warunkach in vitro, a następnie potwierdza obecność tych miejsc w tkankach docelowych, umożliwiając naukowcom opracowanie w niedalekiej przyszłości terapii opartych na CRISPR przy użyciu bezpiecznego i dobrze kontrolowanego systemu.

LabTAG firmy GA International jest wiodącym producentem wysokowydajnych etykiet specjalistycznych orazoraz dostawcą rozwiązań identyfikacyjnych stosowanych w laboratoriach badawczych i medycznych, a także w placówkach służby zdrowia.

Referencje:

1. Gapinske M, Luu A, Winter J, et al. CRISPR-SKIP: Programmable gene splicing with single base editors. Genome Biol. 2018.
2. Li, Y.; Kong, Q.; Yue, J.; Gou, X.; Xu, M.; Wu X. Genome-edited skin epidermal stem cells protect mice from cocaine-seeking behaviour and cocaine overdose. Nat Biomed Eng. 2018.
3. Findlay GM, Daza RM, Martin B, et al. Accurate functional classification of thousands of BRCA1 variants with saturation genome editing. bioRxiv. 2018.
4. Kosicki M, Tomberg K, Bradley A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol. 2018.
5. Akcakaya P, Bobbin ML, Guo JA, et al. In vivo CRISPR-Cas gene editing with no detectable genome-wide off-target mutations. bioRxiv. 2018.